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氨基酸的可见光检测方法
发布时间：2014-11-17
可见光检测法,是通过使氨基酸与衍生试剂发生反应,生成的氨基酸衍生物在可见光光谱范围内有吸收,通过测定吸光度值,根据标准曲线从而得知被测氨基酸的含量。通常能使氨基酸生成在可见光区有吸收的衍生试剂有茚三酮、磺酰氯二甲胺偶氮苯(DABSYL-Cl)等。
茚三酮(nin-hydrin):自从Moore等提出色谱法定量分析氨基酸以来.传统的离子交换色谱及柱后茚三酮衍生检测方法始终占着主导地位.该方法的基本原理是经阳离子交换柱分离出的氨基酸与茚三酮混合,经加热反应后,一级胺与之生成蓝紫色化合物,二级胺与之生成黄色化合物。两种衍生物使用双通道紫外检测器同步检测,检测波长分别为570nm和436nm衍生反应受溶液的pH,温度和反应时间的影响,通常要求在pH5-pH6的弱酸性条件下进行,反应温度的提高可以大大缩短反应时间:在100℃水浴加热时,反应时间需15min,而在130℃时,反应仅需5s。茚三酮衍生显色反应的灵敏度可达2×10-10～5×10-10mol/L,衍生物稳定性较好。衍生剂能同时与一级和二级氨基酸反应并同步检测。其缺点是:衍生反应条件要求较高,需附设加温衍生装置,仪器造价高并专一性强。分析时间长,分析成本高,工作效率低;流动相与衍生液同时泵入体系.体系平衡时间长。
磺酰氯二甲胺偶氮苯(DABSYL-Cl)该衍生法(DABS法)属磺酰卤化物的烷基化修饰。其优点在于:(1)DABSYLAA在可见光区436nm处检测灵敏度(1×10-12mol)与荧光检测(0.5×10-12mol)近似,又可避免使用紫外检测时流动相中微量UV吸收杂质的干扰,因此更为常用。(2)衍生物极其稳定,在碳酸氢钠溶液中室温下可保持一个月以上。(3)衍生方法简单、快速。此法的主要缺点是:DABSYL-Cl与His、Lys、Tyr、Cys2分别形成多种衍生物,它们与其它单衍生物共洗脱,而且多种衍生物的产生不一致,随DAB2SYL-Cl/氨基酸比例而异,因此对未知样品的定量分析及其困难。后来,Chang等人控制DABSYL/氨基酸分子比为4/1～80/L,使上述氨基酸只形成一种衍生物。1985年Stocchi等通过在有机流动相中引入异丙醇首次在室温条件下将包括Asn、Gln、CmCys、Trp在内的约30种氨基酸及其副产物充分分离。目前DABS法已拓展,可对包含各种重要修饰氨基酸在内的复杂氨基酸进行分析
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