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氨基酸柱前衍生的优缺点
发布时间：2014-11-06
邻苯二甲醛(OPA)这种衍生试剂早是用于代替水合苟三酮,以提高柱后衍生离子色谱法的检测灵敏度。用于柱前衍生分析氨基酸产生于1971年I3]。OPA法是目前应用于柱前衍生分析氨基酸普遍的技术之一。OPA与硫醇试剂联用,室温碱性条件下(pH”9.5)迅速与一级氨基酸反应(仅需305),生成具有强荧光的产物1一硫代一2一烷基一异叫噪伍。450nm)。所使用的硫醇试剂通常为2一琉基乙醇(2一MCE)和3一琉基丙酸(3一MPA),但前者有时造成某些氨基酸的分离度较差,故常用后者代替la]。改进的方法,使用小粒径填料(3林m)的短分析柱测定生理体液中的28种游离氨基酸时,分析时间小于13mint。虽然这一方法在实际工作中的荧光检测灵敏度通常为1pmol,但也有报道说低可达5fmol。
优点:以本身不发荧光,色谱分离中不会形成干扰峰;OPA与硫醇试剂连用和一级氨基酸的反应迅速,易于实现在线自动化;柱寿命长,每100一150次分析后更换保护柱,每根分析柱至少可以作700次分析,而保留时间和峰形无明显变化。
缺点:OPA不能直接与二级氨基酸(脯氨酸和经基脯氨酸)反应,需预先氧化开环,补偿这一缺陷可通过与FM0c一cl联用的方法;oPA试剂本身不稳定,容易氧化降解(由无色透明变成微黄色),造成实际工作中试剂的保存困难;0以与氨基酸的衍生产物也不稳定,衍生后需立即进样分析。
氮甲酸茹甲醋(FMOC一Cl)FMOC一Cl在中性溶液中能同时与一级和二级氨基酸迅速反应(305)生成具有强荧光的衍生物,可用荧光检测伍。)也可用紫外检测。衍生产物(组氨酸除外)非常稳定,允许24h内分析。此方法分离生理氨基酸标准混合液中的22种氨基酸可在23min内完成,分离20种氨基酸衍生物为20min。检测灵敏度低于fmol级。
优点:能够同时与一级和二级氨基酸反应,且反应速度快,易于实现自动化。衍生产物稳定,允许24h内上机分析。
缺点:试剂本身及其水解产物FMOC一OH有荧光,色谱分离中会产生一定干扰。实验室中常用戊烷抽提以除去干扰,并能终止反应和防止衍生产物的自然降解。Maeder等161和Keliou等使用柱前自动衍生和多步自动控制程序,实现了不需预先除去剩余试剂而不干扰色谱分离。FMoc一Cl与组氨酸形成的衍生物不稳定,影响定量。
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